在基因治療、細(xì)胞轉(zhuǎn)染等眾多生物醫(yī)學(xué)研究中,PEI轉(zhuǎn)染試劑發(fā)揮著關(guān)鍵作用。以下是它的詳細(xì)配制步驟。
材料和試劑準(zhǔn)備
在進(jìn)行
PEI轉(zhuǎn)染試劑的配制前,需要準(zhǔn)備好相關(guān)材料和試劑。包括高純度的線性PEI粉末、合適的緩沖液(如HEPES緩沖液)、核酸樣品(如質(zhì)粒DNA)以及適量的水等。
第一步:配制PEI溶液
稱取適量的線性PEI粉末,通常根據(jù)所需濃度和轉(zhuǎn)染體系來確定具體用量。一般來說,可將0.5 - 1 g的PEI粉末溶解于適量的無水乙醇中(例如5 - 10 mL),攪拌至全部溶解,得到PEI乙醇溶液。注意要在通風(fēng)良好的環(huán)境下操作,因?yàn)橐掖季哂幸欢ǖ膿]發(fā)性。
第二步:脫醇處理
將PEI乙醇溶液緩慢加入到大量預(yù)冷的去離子水中(例如100 - 200 mL),邊加邊攪拌,使乙醇充分揮發(fā),得到無醇的PEI溶液。這一步非常關(guān)鍵,因?yàn)橐掖伎赡軙?huì)對(duì)后續(xù)的細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用。
第三步:調(diào)節(jié)pH值
使用pH計(jì)測(cè)量PEI溶液的pH值,并將其調(diào)節(jié)至合適的范圍(通常在7.0 - 7.5之間)。可以使用1 M的NaOH或HCl溶液進(jìn)行滴定調(diào)節(jié),同時(shí)不斷攪拌溶液,使pH值穩(wěn)定在目標(biāo)范圍內(nèi)。
第四步:確定轉(zhuǎn)染濃度
根據(jù)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)的具體需求,進(jìn)一步稀釋PEI溶液至合適的濃度。一般來說,常用的轉(zhuǎn)染濃度范圍為1 - 5 μg/mL。
第五步:加入核酸樣品
在含有適量細(xì)胞培養(yǎng)液的細(xì)胞培養(yǎng)板中,加入準(zhǔn)備好的核酸樣品(如質(zhì)粒DNA),然后緩慢加入配制好的PEI溶液,使核酸與PEI按照適當(dāng)?shù)哪柋龋ㄍǔ?:3 - 1:5)混合,輕輕混勻。
第六步:靜置孵育
將轉(zhuǎn)染混合體系放置在37℃、5% CO?的培養(yǎng)箱中靜置孵育一段時(shí)間(一般為4 - 6小時(shí)),使PEI與核酸充分結(jié)合并進(jìn)入細(xì)胞。
第七步:更換培養(yǎng)液
孵育結(jié)束后,小心地吸出舊的培養(yǎng)液,加入新鮮的全部培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞。

通過嚴(yán)格按照上述步驟進(jìn)行PEI轉(zhuǎn)染試劑的配制,可提高轉(zhuǎn)染效率,為后續(xù)的基因治療和細(xì)胞研究提供有力保障。