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技術(shù)文章首頁(yè) > 技術(shù)文章 lip2000脂質(zhì)體2000的兩種轉(zhuǎn)染方法
  • lip2000脂質(zhì)體2000的兩種轉(zhuǎn)染方法
  • 點(diǎn)擊次數(shù):5538 更新時(shí)間:2016-02-24
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  •    lip2000脂質(zhì)體2000適用于把DNA轉(zhuǎn)染入懸浮或貼壁培養(yǎng)細(xì)胞中,是目前條件下zui方便的轉(zhuǎn)染方法之一。轉(zhuǎn)染率高,優(yōu)于磷酸鈣法,比它高5-100倍,能把DNA和RNA轉(zhuǎn)染到各種細(xì)胞。

      用lip2000脂質(zhì)體2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染時(shí),首先需要優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件,應(yīng)找出該批LR對(duì)轉(zhuǎn)染某一特定細(xì)胞適合的用量、作用時(shí)間等,對(duì)每批LR都要做。先要固定一個(gè)DNA的量和DNA/LR混合物與細(xì)胞相互作用的時(shí)間,DNA可從1-5ug和孵育時(shí)間6h,開始,按這兩個(gè)參數(shù)繪出相應(yīng)LR需用量的曲線,再選用LR和DNA兩者*的劑量,確定出轉(zhuǎn)染時(shí)間。因LR對(duì)細(xì)胞有一定的毒性,轉(zhuǎn)染時(shí)間以不超過(guò)24h為宜。COS-7、BHK、NIH-3T3、Hela和Jurkat等任何一種細(xì)胞均可作為受體細(xì)胞。

      lip2000脂質(zhì)體2000的轉(zhuǎn)染方法常見有兩種,具體如下:

      一、快速lip2000脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染法操作步驟

      (1)將細(xì)胞以5 x 10^5個(gè)/孔接種于6孔板中培養(yǎng)24h,使其達(dá)到50%-60%板底面積。在試管中配制DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物。

      a、在1ml無(wú)血清DMEM中稀釋PSV1-neo質(zhì)粒DNA或供體DNA。

      b、旋轉(zhuǎn)1s,再加入脂質(zhì)體懸液,旋轉(zhuǎn)。

      c、室溫下放置5-10min,使DNA結(jié)合在脂質(zhì)體上。

      (2)棄去細(xì)胞中的舊液,用1ml無(wú)血清DMEM洗細(xì)胞1次后棄去,向每孔中直接加入1mlDNA-脂質(zhì)體復(fù)合物,37℃培養(yǎng)3-5天。

      (3)再于每孔中加入含20%胎牛血清的DMEM,繼續(xù)培養(yǎng)14-24h。

      (4)吸出DMEM-DNA-脂質(zhì)體混合物加入新鮮含10%胎牛血清的DMEM,2ml/孔,再培養(yǎng)24-48h。

      (5)用細(xì)胞刮或消化法收集細(xì)胞,以備分析鑒定。

      二、穩(wěn)定的lip2000脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染法

      接種細(xì)胞同前述,細(xì)胞長(zhǎng)至50%板底面積可用于轉(zhuǎn)染。

      DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物制備轉(zhuǎn)染細(xì)胞同前。

      在每孔中加入1ml含20%胎牛血清的DMEM,37℃培養(yǎng)48h。

      吸出DMEM,用G418選擇性培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞,使細(xì)胞生長(zhǎng)一定時(shí)間,篩選轉(zhuǎn)染克隆,方法參照細(xì)胞克隆篩選法進(jìn)行。

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