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技術(shù)文章首頁 > 技術(shù)文章 Western 免疫印跡樣品制備主要步驟及注意事項(xiàng)
  • Western 免疫印跡樣品制備主要步驟及注意事項(xiàng)
  • 點(diǎn)擊次數(shù):1723 更新時(shí)間:2020-10-23
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  •   Western免疫印跡(WesternBlot)是將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上,然后利用抗體進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)已知表達(dá)蛋白,可用相應(yīng)抗體作為一抗進(jìn)行檢測(cè),對(duì)新基因的表達(dá)產(chǎn)物,可通過融合部分的抗體檢測(cè)。
     
      Western Blot 免疫印跡法樣品制備主要步驟:
     
      原始樣品可為細(xì)胞、組織、培養(yǎng)上清、免疫沉淀或親和純化的蛋白,以下為 定性檢測(cè)目的蛋白時(shí)細(xì)胞樣品的處理方法,其余的樣品制備方法參閱相關(guān)文獻(xiàn)。
     
      1、培養(yǎng)細(xì)胞或藥物處理。
     
      2、棄培養(yǎng)基,用1X PBS漂洗細(xì)胞2次,去盡殘留培養(yǎng)基。
     
      3、加入1X SDS樣品緩沖液(6-well plate,100μl /w或 75 cm2 plate,500- 1000μl/瓶) ,刮落細(xì)胞,轉(zhuǎn)移到Ep管。注意:冰上操作。
     
      4、超聲 10~15秒剪切DNA以減低樣品粘性。
     
      5、煮沸樣品5 minutes。
     
      6、離心12000g,5 min,取上清。
     
      7、電泳分離:上樣15μl~20μl 至 SDS-PAGE 膠 (10 cm x 10 cm)電泳。 如要定量檢測(cè)某蛋白的表達(dá)水平, 應(yīng)用RIPA裂解液(1 ml per 107 cells/100 mm dish/150cm2 flask)裂解細(xì)胞, 收集裂解液至離心管中,在振蕩器上混勻4~15min,14000g離心15min(4℃),棄沉淀,用Bradford法或其它蛋白質(zhì)測(cè)定方法測(cè)定上清中蛋白濃度以調(diào)整上樣體積和上樣量,進(jìn)行Western雜交時(shí)還需設(shè)置內(nèi)或外參照,通常用beta-actin。
     
      注意:一般上樣20~30 μg已足夠,如待檢蛋白為低豐度蛋白,可加大上樣量 至100μg,但電泳條帶易拖尾,可制備亞細(xì)胞組份或采用更敏感的檢測(cè)方法。
     
      注意事項(xiàng):
     
      1、操作中戴手套,不要用手觸膜。
     
      2、PVDF膜在甲醇中浸泡時(shí)間不要超過5秒。
     
      3、如檢測(cè)小于20kD的蛋白應(yīng)用0.2μm的膜,并可省略轉(zhuǎn)移時(shí)的平衡步驟。
     
      4、某些抗原和抗體可被Tween-20 洗脫,此時(shí)可用1.0% BSA代替Tween-20。
     
      5、關(guān)于封閉劑的選擇:5%脫脂奶/TBSor PBS: 能和某些抗原相互作用,掩蓋抗體結(jié)合能力;0.3~3% BSA in PBS:低的內(nèi)源性交叉反應(yīng)性。
     
      6、如用0. 1% Tween20、0.02% NaN3 in PBSor TBS作封閉劑和抗體稀釋液,抗體檢測(cè)后可進(jìn)行蛋白染色。
     
      7、如要同時(shí)檢測(cè)大分子量和小分子蛋白,*用梯度膠分離蛋白。
     
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